Комплект для сборки ДНК для разблокировки CRISPR

30 августа 2023 г.

Эта статья была проверена в соответствии с редакционным процессом и политикой Science X. Редакторы выделили следующие атрибуты, гарантируя при этом достоверность контента:

проверенный фактами

рецензируемое издание

надежный источник

корректура

Тамараси Джевандара, Phys.org

Сгруппированные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками (CRISPR) и ассоциированный с Crispr белок 9 (CRISPR/Cas9) в настоящее время являются хорошо известным революционным методом конструирования микробных клеток.

Ключевое преимущество CRISPR остается в дизайне штамма, способствующем интеграции в хромосомы и позволяющему сборку безмаркерной ДНК. Эти системы редактирования очень полезны; однако их сборка не совсем проста и может помешать их использованию и применению.

В новом отчете, опубликованном в журнале Nature Communications Biology, Тигран Юзбашев и исследовательская группа определили ограничения существующих наборов инструментов Cas9, предназначенных для облегчения доступа к методам CRISPR и их реализации. Они обсудили три различных хорошо зарекомендовавших себя метода и объединили их, чтобы сформировать комплексный набор инструментов для эффективной метаболической инженерии с использованием CRISPR/Cas9.

Единый набор инструментов, состоящий из 147 плазмид, позволяет создать и охарактеризовать библиотеку из 137 промоторов для создания гомогентизиновой кислоты в лаборатории.

Система CRISPR/Cas9 может осуществлять быстрые, точные и без рубцов геномные модификации, предоставляя широкие возможности для разработки штаммов микроорганизмов для биопроизводства. Например, метаболическая инженерия дрожжей представляет собой быстрорастущую область инженерной биологии для устойчивого производства химикатов, топлива, продуктов питания и фармацевтических препаратов.

Дрожжи обладают метаболическим потенциалом, как и эукариотические клетки, и поэтому их легче проектировать и культивировать в больших масштабах. В результате биоинженеры спроектировали и разработали системы CRISPR для дрожжей.

Благодаря своей высокой эффективности CRISPR позволяет проводить геномные модификации без маркеров. В этой работе Юзбашев обеспечил оптимизацию штамма и способствовал проектам метаболической инженерии, определив три улучшения системы CRISPR/Cas9 для инженерии дрожжей. Методы включали: 1) простую замену маркерных и безмаркерных модификаций, 2) быструю замену гомологических плеч для определения различных мест интеграции и 3) простой метод клонирования гРНК.

Чтобы обеспечить интеграцию без маркеров на основе CRISPR, команда выбрала двухцепочечный разрыв, индуцированный Cas9, который необходимо было восстановить для обеспечения пролиферации клеток. Ученые сделали это возможным, используя шаблон или донор, интегрированный посредством гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов (NHEJ) — без интеграции. Процесс негомологичного соединения концов наблюдается у большинства видов грибов, включая пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

У видов с преобладающим механизмом NHEJ команда усилила гомологичную рекомбинацию, удалив гены NHEJ. Если безмаркерный метод не увенчался успехом, ученые впоследствии стремятся улучшить интеграцию с помощью CRISPR-Cas9, чтобы легко вернуться к интеграции на основе маркеров.

Интеграция с помощью Cas9 обычно требует донорского шаблона, состоящего из интегрированной кассеты, окруженной двумя гомологичными плечами. Команда предположила, что идеальная интеграция CRISPR/Cas9 должна обмениваться гомологичными плечами на предварительно оцененных донорских конструкциях Cas9 посредством упрощенной реакции сборки Golden Gate.

Более того, промоторы являются ключевым элементом любого проекта метаболической инженерии, позволяющим перенаправить поток на интересующие продукты. Юзбашев и др. использовали промышленные дрожжи Yarrowia lipolytica для разработки набора инструментов метаболической инженерии, который сочетал в себе стратегии редактирования генов и сборки ДНК для обеспечения высокой эффективности и универсальности.